JCI-Gata6 Peritoneal+ macrofagele funcționează ca un portal pentru diseminarea Staphylococcus aureus

infecția cu sânge S. aureus se extinde din ficat în cavitatea peritoneală. Pentru a induce bacteremia în modelul nostru de șoarece, am injectat i.v. 5 107 S. aureus (tulpina Newman sau USA300). Lucrările anterioare au demonstrat că majoritatea bacteriilor sunt capturate în ficat (10). Aici, microscopia intravitală a vasculaturii hepatice (figura 1A) a arătat că GFP S. aureus (verde) a fost capturat aproape exclusiv de celulele F4/80+ Kupffer (violet) și de doar o minoritate de neutrofile Ly6G (roșu) în decurs de 5 minute și fagocitat după 20 de minute (Video suplimentar 1), așa cum s-a raportat anterior (10). Deși majoritatea bacteriilor au fost ucise, un procent mic (aproximativ 10%) de stafilococi a crescut în interiorul celulelor Kupffer (punctele verzi devenind mult mai mari după 8 ore față de 5 minute în figura 1a) și au format microcolonii intracelulare, așa cum se arată folosind o mărire mai mare la 8 ore după infecție (figura 1b). Am raportat anterior folosind reconstrucția 3D și transparența celulelor Kupffer că bacteriile cresc în interiorul și nu în exteriorul macrofagului, demonstrând că au fost fagocitate (10). Aici, am confirmat aceste observații (datele nu sunt prezentate). În primele 24 de ore, am observat o scădere a bacteriilor hepatice în celulele Kupffer, lăsând mici leziuni necrotice lipsite de bacterii și, de asemenea, pierderea mezoteliului podoplanin-pozitiv (albastru) care acoperă suprafața ficatului (figura 1C). Izolarea celulelor Kupffer la 30 de minute după infecție a arătat că unele celule Kupffer care adăpostesc bacterii (săgeată galbenă) au fost capabile să prevină creșterea și să eradice semnalul GFP peste 6 ore. Alte celule Kupffer (săgeata roșie) nu au putut eradica S. aureus, iar bacteriile au crescut rapid și au rupt macrofagul, vărsându-se în fluidul extracelular din acest sistem de cultură celulară (figura 1D și video suplimentar 2). In vitro, aproximativ 60% din celulele Kupffer au eradicat bacteriile (figura 1E). Izolarea întregului ficat in situ la 30 de minute după infecție a arătat că bacteriile depășesc ficatul așa cum am observat in vivo deplasându-se prin mezoteliu (figura suplimentară 1; material suplimentar disponibil online cu acest articol; https://doi.org/10.1172/JCI127286DS1).

S. aureus scapă din celulele Kupffer hepatice și crește în cav peritonealFigura 1

S. aureus scapă din celulele Kupffer hepatice și crește în cavitatea peritoneală. (A) imagini SD-IVM ale GFP S. aureus (verde) capturate de celulele Kupffer (F4/80; Violet) 5 minute (stânga; a se vedea, de asemenea, video suplimentar 1) sau 8 ore (dreapta) după i.v. infecție. Neutrofilele sunt marcate cu roșu (Ly6G). Barete de cantar: 50 unftm. (B) vedere mărită a unei celule Kupffer (F4/80; violet) la 8 ore după infecția cu GFP în creștere S. aureus (verde) în interior. Bar de scara: 10 unftm. (C) imagini reprezentative ale SD-IVM ale ficatului la momentele indicate după infecția i.v. Mesothelium în albastru (podoplanin-EF660), GFP S. aureus în verde strălucitor și hepatocite în autofluorescență verde închis. Bara de scară: 90 de metri cubi (n = 3 pe punct de timp). (D și E) celulele Kupffer au fost izolate de la șoareci infectați cu GFP S. aureus timp de 30 de minute, cultivat și imaginat peste 11 ore ex vivo. (D) imagini reprezentative ale videoclipurilor time-lapse (Video suplimentar 2). Scara bar este de 60 de metri cubi. (E) analiza videoclipurilor time-lapse, 4 FOV pe șoarece; se arată media sem (n = 6 din 4 experimente independente). (F) șoarecii au fost infectați i.v. cu 5 int 107 CFU S. aureus. S-a colectat sânge, s-a efectuat lavaj peritoneal și s-au recoltat organe la punctele de timp indicate din care au fost determinate CFU. Se arată media geometrică (n = 7-9 din 3 experimente independente), Kruskal-Wallis cu testul Post Dunn; *P < 0.05, **P < 0,01 și * * * P < 0,001 comparativ cu punctul de timp de 0,5 ore pentru fiecare organ.

pentru a determina destinația bacteriilor eliberate din ficat in vivo, s-a efectuat o evaluare sistematică a încărcăturii bacteriene în fiecare organ de-a lungul timpului după injectarea i.v. a 5 October 107 S. aureus. În concordanță cu imagistica intravitală, în primele 18 ore de infecție, ficatul a adăpostit majoritatea bacteriilor (figura 1F). Un ordin de mărime mai mic a fost găsit în splină și un ordin de mărime mai mic în plămân (datele nu sunt prezentate). Sechestrarea profundă a bacteriilor de către ficat a dus la doar aproximativ 10.000 de bacterii mL în sânge în decurs de 30 de minute, care au scăzut în continuare la condiții aproape sterile la 18 ore (figura 1F). Niveluri similare de S. aureus au fost observate în rinichi situându-se la 10.000 de bacterii/organ, iar această valoare a rămas aproape neschimbată timp de 18 ore de infecție, sugerând doar o cantitate mică de bacterii și o creștere bacteriană foarte mică în acest organ. De fapt, compartimentul cu cea mai evidentă creștere a încărcăturii bacteriene a fost cavitatea peritoneală. Nu au fost detectate bacterii în cavitatea peritoneală în primele 12 ore, sugerând că S. aureus nu a putut intra în peritoneu din bolusul inițial mare de bacterii injectate în sânge. Cu toate acestea, după 24 de ore, a existat o creștere semnificativă și continuă a bacteriilor în cavitatea peritoneală în următoarele 60 de ore, bacteriile persistând în acest mediu timp de cel puțin 72 de ore. La începutul Fazei 2, a existat o mică reapariție a bacteriilor în sânge (înapoi la 10.000 de bacterii/mL) și o creștere marcată a infecției la rinichi, de peste 1 milion de bacterii/rinichi. La 72 de ore după infecție, această tulpină de S. aureus dobândită în comunitate care are tropism pentru rinichi (16) a fost crescută atât în cavitatea peritoneală, cât și în rinichi (figura 1F), mai mult decât în organele neperitoneale, cum ar fi plămânii (datele nu sunt prezentate). În plus, am observat S. aureus în alte structuri peritoneale, inclusiv peretele peritoneal și grăsimea viscerală peritoneală (figura suplimentară 2) sugerând că majoritatea organelor peritoneale au fost infectate (nu doar rinichii). Majoritatea animalelor au cedat infecției la aproximativ 72 până la 80 de ore. Sarcina crescută de S. aureus în rinichi ar fi putut proveni din creșterea mică a bacteriilor din sânge, cu toate acestea, creșterea remarcabilă a încărcăturii bacteriene în cavitatea peritoneală a fost total neașteptată și, prin urmare, demnă de examinare ulterioară.

macrofagele din cavitatea peritoneală servesc ca rezervor intracelular pentru S. aureus. O evaluare sistematică a cavității peritoneale a fost efectuată cu accent pe interacțiunea dintre S. aureus și celulele imune înnăscute găsite în acest spațiu. Figura 2A arată clar că în primele 24 de ore, nicio bacterie nu a fost liberă și, ca atare, orice bacterie din peritoneu a fost în interiorul celulelor. Există 2 populații rezidente de macrofage peritoneale: celulele mari GATA6+ și celulele mici GATA6 (17, 18). În primele 24 de ore după infectare, majoritatea bacteriilor au fost fagocitate de macrofage peritoneale mari (LPMs; F4/80hi, GATA6+) și într– o măsură mai mică de macrofage peritoneale mici mai puțin abundente (SPMs; F4/80intermed, GATA6 -, MHCIIhi) (figura 2b, strategia de închidere în figura suplimentară 3). Există o rezervă masivă de LPM-uri rezidente, deoarece absorbția completă a bacteriilor a fost realizată de mai puțin de 10% din totalul macrofagelor cavității. Interesant este că nu au fost recrutați neutrofile (Ly6G+) în acest moment și, prin urmare, niciunul nu a contribuit la absorbția bacteriană timpurie (Figura 2, B și C). De asemenea, doar câteva monocite proinflamatorii (Ly6Chi) au fost recrutate la 24 de ore după infecție (Figura 2, B și C). Imagistica confocală a citospin alunecă bacterii confirmate vizual asociate cu LPM și SPM la 24 de ore după infecție (figura suplimentară 4). Interesant este că numărul de LPMs a scăzut foarte semnificativ în următoarele 72 de ore de infecție (figura 2c), amintind de reacția de dispariție a macrofagelor (19). În mod surprinzător, neutrofilele au început să apară doar în cavitatea peritoneală la 48 de ore și în cantități mult mai mari la 72 de ore după infecție (figura 2c). Lucrările anterioare de la noi și alții au arătat că administrarea de S. aureus direct în cavitatea peritoneală (de obicei la concentrații foarte mari) recrutează neutrofile în 4 ore (20-22). În acest model de bacteremie, în care bacteriile au intrat în peritoneu prin celulele Kupffer hepatice, abia la punctul de timp de 48 de ore au fost detectate bacterii extracelulare libere (figura 2a) și neutrofilele au început să fie recrutate (figura 2c). La fel ca neutrofilele, monocitele care devin rapid SPMs au fost, de asemenea, recrutate doar în cavitatea peritoneală la 48 de ore (figura 2c). Între 48 și 72 de ore, neutrofilele recrutate, precum și unele monocite și SPMs, au preluat majoritatea bacteriilor, LPMs reprezentând doar o componentă minoră (14%) (figura 2b). La 72 de ore, bacteriile libere din cavitatea peritoneală au scăzut (figura 2a; 72 de ore) și au început să apară pe suprafața diferitelor organe neperturbate prin spălarea peritoneului (prezentat mai târziu).

 S. aureus infectează macrofagele din interiorul cavității peritoneale.Figura 2

S. aureus infectează macrofagele din interiorul cavității peritoneale. (A–c) analize de citometrie în flux a lavajului peritoneal la momentele indicate după infecție. Strategia de închidere LPM și SPM este prezentată în figura suplimentară 3. (A) numărul Total de GFP liber S. aureus, valoarea medie a sem (n = 2-4 din 2 experimente independente). (B) localizarea celulelor S. aureus în interiorul cavității peritoneale, procent mediu (N = 6 din 3 experimente independente). (C) analize cantitative pentru numărul total de celule de LPMs, SPMs, monocite și neutrofile în timpul infecției. Cutiile se extind de la percentilele 25 la 75, mustățile arată de la minim la maxim, iar liniile indică mediana. n = 3-8 din cel puțin 2 experimente independente, Kruskal-Wallis cu testul Post Dunn, * P < 0,05 și **P < 0,01. (D și E) celulele peritoneale au fost recoltate la 46 de ore după infecția cu sânge GFP S. aureus, iar macrofagele F4/80+ sau neutrofilele Ly6G+ au fost izolate, cultivate și imaginate ex vivo. (D) sunt afișate imagini reprezentative ale videoclipurilor time-lapse (Video suplimentar 3). (E) analiza videoclipurilor time-lapse, 4 FOV pe șoarece (n = 4 din 2 experimente independente).

pentru a înțelege mai bine soarta lui S. aureus în cadrul neutrofilelor și LPMs, aceste celule au fost recoltate și separate la 48 de ore după infecție pentru experimente in vitro. Figura 2D evidențiază dihotomia spectaculoasă în manipularea S. aureus de către cele 2 tipuri de celule; neutrofilele peritoneale pozitive pentru bacteriile GFP au reținut agenții patogeni intracelular cu o creștere foarte mică a semnalului GFP. În schimb, LPMs a devenit frecvent supraîncărcat de bacterii în decurs de 2 ore, bacteriile erupând în cele din urmă din aceste celule (Figura 2, D și E și video suplimentar 3) doar pentru a fi preluate de mai multe LPMs. Această situație ar putea explica foarte probabil scăderea semnificativă a numărului acestor macrofage pe parcursul celor 72 de ore de infecție (figura 2c). Am emis ipoteza că S. aureus a deturnat LPMs în peritoneu, limitând răspunsul neutrofil și monocitar și creând un portal pentru diseminarea bacteriană către alte organe peritoneale.

lipsa macrofagelor peritoneale GATA6+ duce la o diseminare mai mică a S. aureus la rinichi. GATA6 + este un factor de transcripție specific pentru LPMs în celulele hematopoietice și nu este exprimat în alte macrofage, inclusiv SPMs sau celule Kupffer (18, 23, 24) și nu se găsește, de asemenea, în celulele fagocitare renale, monocite, neutrofile sau neutrofile care au migrat în rinichi (figura suplimentară 5). Pentru a determina rolul LPMs în cavitatea peritoneală, am folosit șoareci Lyz2-Cre GATA6fl/fl (GATA6-KOmye) cărora le lipsește majoritatea macrofagelor GATA6+, dar s-a raportat că nu au alte defecte fenotipice (18, 23, 24). Nu este surprinzător, în comparație cu controalele littermate, acești șoareci nu au prezentat nicio diferență în sarcina bacteriană în ficat (figura 3a), deoarece populația de celule Kupffer nu este modificată la șoarecii GATA6-KOmye (24). În plus, numărul de bacterii din sânge a fost, de asemenea, aproape de limitele de detectare și nu a fost diferit între cele 2 tulpini de șoareci (figura 3b). Cu toate acestea, la 48 de ore după infecție, am văzut o reducere semnificativă de 100 de ori a bacteriilor asociate cu rinichii șoarecilor care nu aveau LPMs GATA6+ demonstrând un rol pentru aceste celule în S. diseminarea aureus în organele peritoneale (figura 3C). La primele 12 ore de la infectare, nu s-a observat nicio diferență în sarcina bacteriană la rinichii șoarecilor WT și GATA6-KOmye (figura 3D), sugerând că infecția renală timpurie mică nu are legătură cu cavitatea peritoneală sau macrofagele GATA6+.

lipsa macrofagelor peritoneale are ca rezultat recrutarea mai multor neutrofile șiFigura 3

lipsa macrofagelor peritoneale are ca rezultat recrutarea mai multor neutrofile și diseminarea mai redusă a S. aureus la rinichi. Șoarecii GATA6-KOmye sau subiecții de control littermate au fost infectați i. v. (A–H) sau I.p. (I și J) Pentru momentele de timp indicate, cu 5 tulpini de S. aureus Newman de la 5 la sută 107. (A-E și J) organele au fost colectate și CFU determinat; este prezentată media geometrică. n = 5-10 din cel puțin 2 experimente independente, testul Mann-Whitney, * P < 0,05. (F) localizarea celulelor S. aureus în interiorul cavității peritoneale determinată prin citometrie în flux, procentaj mediu. n = 5 (WT) sau 6 (GATA6-KOmye). (G și I) Numărul de neutrofile din cavitatea peritoneală evaluat prin citometrie în flux. n = 5-6, valoarea medie a sem-ului inqc, testul t nepereche, * * P < 0,01. (H) pierderea în greutate corporală, n = 6-9 din 3 experimente independente, media sem-ului la sută, testul t nepereche, *P < 0,05.

sarcina bacteriană în cavitatea peritoneală a fost aceeași la șoarecii GATA6-KOmye și la subiecții de control littermate (figura 3e). Cu lipsa LPMs la acești șoareci, totuși, majoritatea S. aureus au fost găsite în neutrofile (figura 3F) în parte datorită unei creșteri mari a numărului de neutrofile (figura 3G). În mod clar, bacteriile nu au putut disemina la fel de eficient atunci când au fost în neutrofile în loc de macrofage GATA6+. Șoarecii GATA6-KOmye au apărut, de asemenea, mai sănătoși și au pierdut mai puțină greutate corporală decât controalele littermate (figura 3h).

injectarea directă de S. aureus în cavitatea peritoneală a determinat o creștere foarte semnificativă timpurie (4 ore) a neutrofilelor (1-2 milioane) în cavitatea peritoneală (figura 3i), cu unele infecții renale la 72 de ore (figura 3j), așa cum s-a descris anterior (25). La șoarecii cu deficit de GATA6, influxul de neutrofile a fost triplat (4-6 milioane) și s-a observat o povară bacteriană mai mică la rinichi la 3 zile după infecția cu I.p. (Figura 3, I și J). Când am măsurat nivelurile de chemokine de recrutare a neutrofilelor, CXCL1 și CXCL2, în cavitatea peritoneală, am fost surprinși să găsim creșteri foarte robuste la 4 ore după injectarea I.p. de S. aureus, dar nu după primele 24 de ore de la injectarea i.v. a bacteriilor (figura suplimentară 6).

S. aureus infectează rinichiul în principal din peritoneu, nu din vasculatură. Microscopul intravital Leica Dive 2-photon (IVM) a fost folosit pentru a vizualiza S. aureus în microvasculatura rinichiului, inclusiv cea a glomerulilor, care la șoarecii adulți sunt aproape imposibil de vizualizat cu IVM standard datorită adâncimii lor sub suprafață. Am putut, de asemenea, să cusăm imagini astfel încât să se poată observa până la 20 de glomeruli simultan, care ar putea fi apoi mărite după cum este necesar și să apară ca mici sferoide gri (figura 4a și figura suplimentară 7a). În ciuda sechestrarea masivă a S. aureus în microvasculatura hepatică (figura 1a), foarte puține bacterii au fost observate aderente (staționare) fie în microvasculatura interstițială, fie glomerulară a rinichiului (videoclipuri suplimentare 4-6) în primele 30 de minute de infecție. În plus, în rare ocazii, am observat bacterii ingerate în neutrofile atașate capilarelor glomerulare, dar aceste celule s-au detașat apoi de vasculatura renală și au reintrat în fluxul sanguin (figura 4B și video suplimentar 5). Nu s-a observat niciodată că neutrofilele suferă o retenție prelungită în vasculatura renală. Nu a existat o creștere persistentă a S. aureus în niciunul dintre multele glomeruli la nenumărații șoareci pe care i-am imaginat. De fapt, am găsit doar 1 glomerul infectat cu S. aureus la 72 de ore după infecție (figura suplimentară 7A). În plus, unele studii sugerează că fagocitele renale cx3cr1+ monitorizează microvasculatura renală și captează bacteriile Gram-negative și materialul de particule din circulație (26, 27). Cu toate acestea, în experimentele noastre de imagistică, Niciun fagocit renal cx3cr1+ nu conținea nicio bacterie în primele 30 de minute după I.v. infecția (video suplimentar 6) și datele citometriei în flux arată că acest lucru nu se schimbă în timp, niciodată crescând peste 0,5% (figura suplimentară 7B). În timp ce foarte puține bacterii observate în rinichi folosind imagistica sunt în întregime în concordanță cu foarte puține CFU (104 CFU) detectate în primele 24 de ore, lipsa recrutării neutrofilelor și lipsa bacteriilor în diferitele compartimente ale rinichiului nu au fost în concordanță cu creșterea încărcăturii bacteriene în rinichi după 24 de ore.

S. aureus infectează rinichiul inițial pe capsulă și apoi se infiltrează iFigura 4

S.aureus infectează rinichiul inițial pe capsulă și apoi se infiltrează în interstițiu. (A) imagine reprezentativă cusută cu 2 fotoni de la rinichi în jur de 150 de milimetri Adâncime, unde se pot vedea aproximativ 20 de glomeruli (stânga). Vasculatura, inclusiv glomerulii, apare în gri (AF680-albumină), tubulii apar în autofluorescență galben închis, iar S. aureus este în GFP verde strălucitor (nu este vizibil). Panoul din dreapta prezintă 3 glomeruli măriți. (B) Imagini IVM cu doi fotoni dintr-un glomerul (video suplimentar 5) în timpul primelor 10 minute de infecție I.v. cu 5 October 107 S. aureus Newman. Vasculatura (glomerul) este prezentată în albastru (Qtracker 655), tubulii sunt autofluorescenți în toate canalele și apar în maro în jurul glomerului, neutrofilele sunt etichetate în roșu (Ly6G-PE), iar GFP S. aureus apare în galben în interiorul unui neutrofil (săgeată albă). (C) imagini reprezentative cusute de pe suprafețele renale în momentele indicate după infecție. Bar de scară: 500 unftm. S. aureus (verde strălucitor) este încercuit în alb și este prezentată o vedere mărită a bacteriilor la suprafață la 48 de ore. (D) reprezentarea 3D FOV a unui rinichi la 48 de ore după infecția cu GFP S. aureus (verde strălucitor ) pe capsulă (colagen violet/a doua generație armonică) și vasculatura în gri (AF680-albumină). (E) FOV reprezentativ al unui rinichi la 72 de ore după infecție, vedere din partea de jos a stivei Z. Tubulii apar autofluorescenți în maro, GFP S. aureus este verde strălucitor și indicat cu săgeți albe. (F) analiza localizării bacteriilor, așa cum a fost determinată folosind 2-fotoni IVM ai rinichiului. Au fost analizate șase FOV pe șoarece (n = 3-4 pe punct de timp).

interesant, nu a existat o creștere a neutrofilelor aderente în glomeruli sau microvasculatura interstițială până la 72 de ore după infecție (figura suplimentară 8a). Neutrofilele au fost reținute atât în glomeruli, cât și în microvasculatura interstițială a rinichiului timp de aproximativ 2 până la 3 minute în condiții bazale, iar această valoare nu a crescut în timp după infecție (figura suplimentară 8B) sugerând puține dovezi de inflamație în vasculatura renală. De asemenea, am evaluat recrutarea leucocitelor renale prin citometria în flux a rinichilor digerați. Aceste experimente au evidențiat o creștere minoră a numărului total de neutrofile în rinichi la 48 de ore, urmată de recrutarea dramatică la 72 de ore după infecție (figura suplimentară 8, C și D). Este de remarcat faptul că foarte puține neutrofile au ingerat S. aureus în primele 24 de ore și chiar la 48 și 72 de ore, doar 15% dintre neutrofilele recrutate au fost pozitive pentru GFP S. aureus (figura suplimentară 8, E și F), indicând accesul slab la bacterii.

numărul de neutrofile din sânge a fost, de asemenea, examinat utilizând citometria în flux pentru a determina numărul de neutrofile care au legat sau ingerat S. aureus. Numărul de neutrofile purtătoare de GFP S. aureus a fost în mod constant mai mic de 0,1% din total pentru întreaga perioadă de 72 de ore după infecție (figura suplimentară 9), în ciuda unei creșteri uriașe a încărcăturii bacteriene asociate cu rinichii. Împreună cu imagistica care nu arată bacterii în vasculatură și aceste date de citometrie în flux, a existat o lipsă de sprijin convingător pentru opinia predominantă că bacteriile ajung la rinichi prin vasculatura din interiorul neutrofilelor sau chiar ca entități libere.

deoarece bacteriile nu par să se disemineze prin vasculatură, am vizualizat rinichii din punct de vedere peritoneal și în imagini de ansamblu, am văzut creșterea creșterii bacteriilor pe capsula renală la 24 de ore (nu este prezentată), 48 de ore și 72 de ore (figura 4c). Deși la 24 de ore bacteriile păreau să fie în colonii mici ferm aderente și stropite pe suprafața capsulei renale (nu sunt prezentate), aceste colonii au crescut vizibil la 48 de ore formând biofilme cu zone concentrate de fluorescență intensă sugerând zone izolate ale coloniilor mari. În timp ce această apariție nu a fost raportată la om, este puțin probabil ca aceste aglomerări de bacterii să fie detectate prin ultrasunete și alte abordări clinice. Este de remarcat faptul că încărcătura bacteriană medie nu s-a schimbat semnificativ între 24 și 72 de ore, iar bacteriile păreau să fie mult mai puțin dispersate și în aglomerări mai concentrate la momente ulterioare. Microscopia cu doi fotoni și utilizarea generației a doua armonice (denotă colagen) pentru a delimita locația capsulei renale au evidențiat bacterii atașate la suprafață și nu sub capsulă la 48 de ore (figura 4D și video suplimentar 7), în timp ce la 72 de ore, bacteriile au devenit vizibile mai adânc în parenchim (figura 4e). Până la 72 de ore, infecția s-a răspândit de la suprafața rinichiului la interstițiu, dar nu a fost aproape niciodată vizibilă în glomeruli (figura suplimentară 7A). Cuantificarea numărului total de bacterii individuale/clustere bacteriene a arătat că la 24 de ore, toate bacteriile se aflau pe capsula renală, în timp ce la 48 și 72 de ore, a existat un număr tot mai mare de bacterii în interstițiu (figura 4F). Această observație a sugerat că bacteriile infectau rinichiul de pe suprafața exterioară spre interior prin cavitatea peritoneală. În concordanță cu această idee, este bine cunoscut faptul că injectarea bacteriilor direct în cavitatea peritoneală duce la formarea abcesului inițial pe suprafața renală urmată de invazia în interstițiu (16, 25), un model frecvent utilizat de insuficiență renală. De asemenea, am evaluat moartea celulară în rinichi și am observat foarte puțină moarte celulară tubulară la 24 de ore, dar aceasta a fost mult crescută la 48 și 72 de ore (figura suplimentară 8, G și H). Creatinina plasmatică a fost, de asemenea, măsurată ca un indice al ratei de filtrare glomerulară și al funcției renale afectate, dar datele nu au arătat nicio corelație cu infecția locală. Nu a existat nicio creștere a creatininemiei în niciun moment, cu excepția celor 24 de ore (figura suplimentară 4I). Creșterea temporară precoce a creatininei este în concordanță cu raportul nostru conform căruia toxina de la S. aureus eliberată în fluxul sanguin de la S. aureus sechestrat în ficat a provocat agregarea plachetară în capilare, inclusiv glomeruli renali, ceea ce a dus la o filtrare temporară afectată (28).

eradicarea S. rezervorul aureus în cavitatea peritoneală cu lipozomi umpluți cu antibiotice are ca rezultat o supraviețuire mai bună. Pentru infecțiile cu sânge la om, vancomicina i.v., un antibiotic puternic pentru S. aureus, este recomandată timp de minimum 4 până la 6 săptămâni, deși succesul poate fi limitat (5). În experimentele actuale, administrarea intravenoasă de vancomicină timp de 1, 2 sau 3 zile începând cu 24 de ore după infecție (pentru a imita situația clinică) a avut un efect marginal asupra încărcăturii bacteriene asociate cu rinichiul sau peritoneul la 72 de ore (figura 5A și figura suplimentară 10a). Mai mult, numărul de celule tubulare moarte (Figura 5, B și C), pierderea în greutate (figura suplimentară 10B) și supraviețuirea (figura 5D) nu au fost îmbunătățite. Interesant, divizarea dozei de vancomicină și administrarea jumătății i. v. și cealaltă jumătate în cavitatea peritoneală a redus infecția în cavitatea peritoneală, a redus numărul de bacterii și leziuni tubulare în rinichi și a îmbunătățit semnificativ ratele de mortalitate (Figura 5, A–D). Am raportat anterior că vancomicina liberă nu a pătruns bine în macrofagele tisulare (10). În schimb, vancomicina încorporată în lipozomi (vancozomi) a fost preluată cu voracitate de celulele Kupffer la 30 de minute după infecție, ajutând la eradicarea S. aureus în interiorul acestor celule (10). Cu toate acestea, protocolul de 30 de minute după infecție utilizat în studiul nostru anterior, deși suficient pentru dovada conceptului, este puțin probabil să fie relevant din punct de vedere clinic. Deoarece bacteriile sunt eliberate din ficat în cavitatea peritoneală la aproximativ 8 ore, administrarea vancozomilor i.v. la 24 de ore ar fi prea târziu. Prin urmare, am injectat vancosomi i.p. la 24 de ore și a observat o absorbție masivă a acestor lipozomi de către macrofage peritoneale. Este de remarcat faptul că atunci când lipozomii au fost administrați i.p., au putut accesa vasculatura unde au fost preluați de celulele Kupffer, dar nu de celulele fagocitare renale (figura suplimentară 11). Prin urmare, vancozomii nu funcționau în macrofagele renale.

vancomicina lipozomală intraperitoneală (vancozomi) vizează țesutul rezident mFigura 5

vancomicina lipozomală intraperitoneală (vancozomi) vizează macrofagele rezidente în țesut pentru eradicarea infecțiilor și susținerea supraviețuirii. Șoarecii au fost infectați i.v.cu 5 int. 107 S. aureus Newman și tratați 2 (24 ore plus 48 ore, A–C) sau de 3 ori (24 ore plus 48 ore plus 72 ore, D) fie cu vancomicină i.v (roșu), vancosomi I. P. (albastru), o combinație de vancomicină i. v.plus i. p. (portocaliu), fie cu vancomicină i. v.plus vancosomi I. P. (verde). (A) la șaptezeci și două de ore după infecție, s-au recoltat organe, s-a efectuat lavaj peritoneal și s-au determinat CFU (n = 6-11 din 3 experimente independente). Datele sunt prezentate ca media geometrică; Kruskal-Wallis cu testul Post Dunn; * P < 0,05 și **P < 0,01. (B) imagini reprezentative cu 2 fotoni IVM ale rinichilor la 72 de ore după infecție cu sau fără tratament de 2 ori. Celulele tubulare moarte sunt colorate cu portocaliu Sytox (roșu), tubulii apar în autofluorescență verde închis. Bară de scară: 75 unft.m. (C) analiza B. Numărul de celule Sytox Orange + (moarte) de la 8 FOV pe șoarece, datele reprezintă valoarea medie a sem (n = 3, 1-way ANOVA cu testul de comparații Multiple al lui Bonferroni). * P < 0, 05, ***P < 0, 001 și ****P < 0, 0001. (D) curba de supraviețuire a șoarecilor infectați și tratați cu S. aureus (n = 4 șoareci pe grup din 2 experimente independente). Testul Log-rank comparativ cu vancomicina i.v., *P < 0,05 și **P < 0,01.

reducerea profundă a încărcăturii bacteriene în cavitatea peritoneală după vancozomi a redus încărcătura bacteriană în rinichi la 50% dintre șoareci (figura 5A) și a dus la mai puține leziuni renale (Figura 5, B și C) și o supraviețuire mai bună (figura 5D). Interesant este că unele bacterii au reușit încă să crească pe capsula renală, sugerând că vancozomii au fost mai puțin eficienți la uciderea bacteriilor extracelulare. Am observat o mai bună eradicare a bacteriilor libere cu vancomicină și o mai bună eradicare a bacteriilor intracelulare cu vancozomi (figura suplimentară 10C). Combinația de vancomicină i. v. și vancozomii I.p., care ar fi cea mai probabilă alegere într-un studiu clinic, au eliminat toate bacteriile din cavitatea peritoneală la toți șoarecii și nicio bacterie nu a ajuns la rinichi la mai mult de 50% dintre șoareci (figura 5A). Când șoarecii au fost tratați cu doar 1 injecție la 24 de ore, Rezultatele au fost moderat mai puțin eficiente (figura suplimentară 10A). Cel mai important, șoarecii tratați cu vancozomi tandem i.p. și vancomicină i.v. au crescut supraviețuirea cu 80% la 10 zile, în ciuda unui regim antibiotic de 3 zile (figura 5D). Aceste protocoale ar putea fi transpuse cu ușurință în practica clinică la pacienții infectați.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.