JCI – peritoneal GATA6 + makrofagi działają jako portal dla rozprzestrzeniania Staphylococcus aureus

krwiobieg zakażenie S. aureus rozszerza się z wątroby do jamy otrzewnej. Aby wywołać bakteriemię w naszym mysim modelu, wstrzyknęliśmy dożylnie 5 × 107 S. aureus (Newman lub szczep USA300). Wcześniejsze prace wykazały, że większość bakterii jest wychwytywana w wątrobie (10). W tym przypadku, mikroskopia do ciała szklistego naczyń wątroby (Fig. 1a) wykazała, że GFP S. aureus (zielony) był prawie wyłącznie wychwytywany przez komórki F4 / 80+ Kupffera (fioletowy) i tylko przez mniejszość neutrofili Ly6G (czerwony) w ciągu 5 minut, a fagocytoza po 20 minutach (dodatkowe Wideo 1), Jak wcześniej informowano (10). Chociaż większość bakterii została zabita, niewielki procent (około 10%) gronkowców rosło wewnątrz komórek Kupffera (zielone kropki stają się znacznie większe po 8 godzinach w porównaniu do 5 minut na fig.1A) i tworzyły wewnątrzkomórkowe mikrokolonie, jak pokazano przy większym powiększeniu po 8 godzinach po zakażeniu (Fig. 1B). Wcześniej informowaliśmy o użyciu rekonstrukcji 3D i przezroczystości komórek Kupffera, że bakterie rosną wewnątrz, a nie na zewnątrz makrofagów, wykazując, że zostały one fagocytozowane (10). Tutaj potwierdziliśmy te obserwacje (dane nie pokazane). W ciągu pierwszych 24 godzin obserwowaliśmy zmniejszenie liczby bakterii wątrobowych w komórkach Kupffera, pozostawiając niewielkie zmiany martwicze pozbawione bakterii, a także utratę podoplanin-dodatniego mesothelium (niebieskiego), który pokrywa powierzchnię wątroby (ryc. Izolacja komórek Kupffera 30 minut po zakażeniu wykazała, że niektóre komórki Kupffera zawierające bakterie (żółta strzałka) były w stanie zapobiec wzrostowi i wyeliminować sygnał GFP w ciągu 6 godzin. Inne komórki Kupffera (czerwona strzałka) nie były w stanie wykorzenić S. aureus, a bakterie szybko rosły i pękały makrofagi, rozlewając się do płynu pozakomórkowego w tym systemie hodowli komórkowej (Fig.1D i dodatkowe Wideo 2). In vitro około 60% komórek Kupffera wytępiło bakterie (ryc. 1e). Izolacja całej wątroby in situ 30 minut po zakażeniu ujawniła, że bakterie przerastają wątrobę, gdy obserwowaliśmy in vivo poruszanie się po mesothelium (uzupełniający Rysunek 1; materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; https://doi.org/10.1172/JCI127286DS1).

S. aureus ucieka z komórek Kupffera wątroby i wyrasta do jamy otrzewnowejryc. 1

S. aureus ucieka z komórek Kupffera wątroby i wyrasta do jamy otrzewnowej. A) obrazy SD-IVM GFP S. aureus (zielony) połowu przez komórki Kupffera (F4 / 80; fioletowy) 5 minut (po lewej; patrz również dodatkowe Wideo 1) lub 8 godzin (po prawej) po infekcji dożylnej. Neutrofile są oznaczone kolorem czerwonym (Ly6G). Podziałka: 50 µm. (B)powiększony widok komórki Kupffera (F4 / 80; fioletowy) 8 godzin po zakażeniu rosnącym GFP S. aureus (zielony) wewnątrz. Pasek skali: 10 µm. C) reprezentatywne obrazy SD-IVM wątroby we wskazanych punktach czasowych po infekcji IV. Mesothelium w Kolorze Niebieskim (podoplanin-EF660), GFP S. aureus w jasnozielonym, a hepatocyty w ciemnozielonym autofluorescencji. Pasek skali: 90 µm (N = 3 na punkt czasowy). (D i E) komórki Kupffera izolowano od myszy zakażonych GFP S. aureus przez 30 minut, hodowany i obrazowany przez 11 godzin ex vivo. (D) reprezentatywne obrazy filmów poklatkowych (film uzupełniający 2). Pasek skali wynosi 60 µm. (E) Analiza filmów poklatkowych, 4 FOV na mysz; pokazana jest średnia ± sem (N = 6 z 4 niezależnych eksperymentów). (F) myszy zakażono dożylnie 5 × 107 CFU S. aureus. Pobrano krew, wykonano płukanie otrzewnej i pobrano narządy we wskazanych punktach czasowych, z których oznaczono CFU. Pokazana jest średnia geometryczna (n = 7-9 z 3 niezależnych eksperymentów), Kruskal-Wallis z testem post Dunna; *P < 0.05, **P < 0, 01 I * * * P < 0, 001 w porównaniu z punktem czasowym 0, 5 godziny dla każdego narządu.

w celu określenia przeznaczenia bakterii uwalnianych z wątroby in vivo, przeprowadzono systematyczną ocenę obciążenia bakteryjnego w każdym narządzie w czasie po dożylnym wstrzyknięciu 5 × 107 S. aureus. Zgodnie z obrazowaniem do ciała szklistego, w ciągu pierwszych 18 godzin infekcji w wątrobie znajdowała się większość bakterii (rycina 1F). Rząd wielkości mniej stwierdzono w śledzionie, a kolejny rząd wielkości mniej w płucach (dane nie zostały przedstawione). Głęboka sekwestracja bakterii przez wątrobę spowodowała, że w ciągu 30 minut we krwi znalazło się tylko około 10 000 ml bakterii, które następnie spadły do prawie sterylnych warunków po 18 godzinach (Fig. Podobne poziomy S. aureus zaobserwowano w nerce unosząc się na 10.000 bakterii / organ, a wartość ta pozostała prawie niezmieniona przez 18 godzin infekcji sugerując tylko niewielką ilość bakterii i bardzo mały wzrost bakterii w tym narządzie. W rzeczywistości komora z najbardziej oczywistym wzrostem obciążenia bakteryjnego była jamą otrzewnową. Nie wykryto bakterii w jamie otrzewnej w ciągu pierwszych 12 godzin, co sugeruje, że S. aureus nie mógł dostać się do otrzewnej z początkowego dużego bolusa bakterii wstrzykniętych do krwiobiegu. Jednak po 24 godzinach nastąpił znaczny i ciągły wzrost liczby bakterii w jamie otrzewnej w ciągu następnych 60 godzin, a bakterie utrzymywały się w tym środowisku przez co najmniej 72 godziny. Na początku fazy 2 doszło do niewielkiego ponownego pojawienia się bakterii we krwi (do 10 000 bakterii / mL) i znacznego wzrostu zakażeń w nerkach, o ponad 1 milion bakterii / nerki. Do 72 godzin po zakażeniu, szczep S. aureus, który ma tropizm dla nerek (16), został podwyższony zarówno w jamie otrzewnej, jak i w nerkach (Fig. 1F), bardziej niż w narządach nieotrzewnowych, takich jak płuca (dane nie pokazane). Ponadto obserwowaliśmy S. aureus w innych strukturach otrzewnej, w tym w ścianie otrzewnej i otrzewnej tłuszczu trzewnego (Uzupełnienie rycina 2), co sugeruje, że większość narządów otrzewnej była zakażona (nie tylko nerki). Większość zwierząt Uległa infekcji po około 72-80 godzinach. Zwiększone obciążenie S. aureus w nerkach mogło pochodzić z niewielkiego wzrostu liczby bakterii we krwi, jednak niezwykły wzrost obciążenia bakteryjnego w jamie otrzewnej był całkowicie nieoczekiwany i dlatego wart dalszych badań.

makrofagi w jamie otrzewnej służą jako wewnątrzkomórkowy zbiornik dla S. aureus. Przeprowadzono systematyczną ocenę jamy otrzewnej z naciskiem na interakcję między S. aureus a wrodzonymi komórkami odpornościowymi znajdującymi się w tej przestrzeni. 2A wyraźnie pokazuje, że w ciągu pierwszych 24 godzin żadne bakterie nie były wolne i jako takie, wszelkie bakterie w otrzewnej znajdowały się wewnątrz komórek. Istnieją 2 populacje makrofagów otrzewnowych: Duże GATA6 + i małe GATA6– komórki (17, 18). W ciągu pierwszych 24 godzin po zakażeniu większość bakterii była fagocytozowana przez duże makrofagi otrzewnowe (LPMs; F4 / 80hi, GATA6+) i w mniejszym stopniu przez mniej obfite małe makrofagi otrzewnowe (SPMs; F4 / 80intermed, GATA6 -, MHCIIhi) (Fig. Istnieje ogromna rezerwa rezydujących LPM, ponieważ całkowite wychwycenie bakterii zostało osiągnięte przez mniej niż 10% makrofagów w całkowitej jamie. Co ciekawe, w tym czasie nie zrekrutowano neutrofili (Ly6G+), więc żaden nie przyczynił się do wczesnego wychwytu bakterii (fig.2, B I C). Ponadto tylko kilka prozapalnych monocytów (Ly6Chi) zostało zrekrutowanych 24 godziny po zakażeniu (fig.2, B I C). Konfokalne obrazowanie szkieł Cytospin wizualnie potwierdzonych bakterii związanych z LPM i SPM 24 godziny po zakażeniu (Uzupełnienie rycina 4). Co ciekawe, liczba LPM spadła bardzo znacząco w ciągu następnych 72 godzin infekcji (rysunek 2C), przypominając reakcję znikania makrofagów (19). Co zaskakujące, neutrofile zaczęły pojawiać się w jamie otrzewnej dopiero po 48 godzinach i w znacznie większych ilościach po 72 godzinach od zakażenia (Fig. Wcześniejsze prace od nas i innych wykazały, że podawanie S. aureus bezpośrednio do jamy otrzewnej (zwykle w bardzo wysokich stężeniach) rekrutuje neutrofile w ciągu 4 godzin (20-22). W tym modelu bakteriemii, w którym bakterie dostały się do otrzewnej przez komórki Kupffera wątroby, dopiero w 48-godzinnym punkcie czasowym wykryto wolne bakterie zewnątrzkomórkowe (Fig.2a) i zaczęto rekrutować neutrofile (Fig. 2C). Podobnie jak neutrofile, monocyty, które szybko stają się SPM, rekrutowano do jamy otrzewnowej dopiero po 48 godzinach (Fig.2C). Pomiędzy 48 A 72 godzinami rekrutowane neutrofile, jak również niektóre monocyty i SPM, zajęły większość bakterii z LPM, które stanowią tylko niewielki Składnik (14%) (Fig.2b). Po 72 godzinach wolne bakterie w jamie otrzewnej zmniejszyły się (ryc. 2A; 72 godziny) i zaczęły pojawiać się na powierzchni różnych narządów niezakłóconych przez przemywanie otrzewnej (pokazane później).

S. aureus infekuje makrofagi wewnątrz jamy otrzewnowej.fig. 2

S. aureus infekuje makrofagi wewnątrz jamy otrzewnowej. (A–C) analizy cytometrii przepływowej płukania otrzewnej we wskazanych punktach czasowych po zakażeniu. Strategia bramkowania LPM i SPM przedstawiona jest na rysunku uzupełniającym 3. (A) całkowita liczba wolnych GFP S. aureus, średnia ± sem (n = 2-4 z 2 niezależnych eksperymentów). (B)lokalizacja komórek S. aureus wewnątrz jamy otrzewnej, średni procent (N = 6 z 3 niezależnych eksperymentów). (C) analizy ilościowe dla całkowitej liczby komórek LPMs, SPMs, monocytów i neutrofili w czasie infekcji. Pola rozciągają się od 25. do 75. percentyla, wąsy pokazują od minimum do maksimum, a linie wskazują medianę. N = 3-8 z co najmniej 2 niezależnych eksperymentów, Kruskal-Wallis z testem post Dunna, *p < 0,05 i * * p < 0,01. (D i E) komórki otrzewnowe pobrano 46 godzin po zakażeniu krwi GFP S. aureus, a makrofagi F4 / 80+ lub neutrofile Ly6G+ wyizolowano, hodowano i zobrazowano ex vivo. (D) wyświetlane są reprezentatywne obrazy filmów poklatkowych (film uzupełniający 3). (E) Analiza filmów poklatkowych, 4 FOV na mysz (n = 4 z 2 niezależnych eksperymentów).

aby lepiej zrozumieć los S. aureus wewnątrz neutrofili i LPM, komórki te zostały zebrane i oddzielone w 48 godzin po zakażeniu do eksperymentów in vitro. Rysunek 2D podkreśla spektakularną dychotomię w obsłudze S. aureus przez 2 typy komórek; otrzewnowe neutrofile dodatnie dla bakterii GFP zatrzymywały patogeny wewnątrzkomórkowo z bardzo niewielkim wzrostem sygnału GFP. W przeciwieństwie do tego, LPM często były zarastane przez bakterie w ciągu 2 godzin, a bakterie ostatecznie wybuchały z tych komórek (ryc. 2, D I E oraz dodatkowe wideo 3), aby mogły być pobierane przez więcej LPM. Sytuacja ta może z dużym prawdopodobieństwem tłumaczyć znaczny spadek liczby tych makrofagów w ciągu 72 godzin infekcji (Fig. 2C). Postawiliśmy hipotezę, że S. aureus porwał LPM w otrzewnej, ograniczając odpowiedź neutrofilową i monocytową i tworząc portal do rozprzestrzeniania się bakterii do innych narządów otrzewnej.

brak GATA6+ makrofagów otrzewnowych prowadzi do mniejszego rozprzestrzeniania się S. aureus do nerek. GATA6+ jest specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym dla LPM w komórkach krwiotwórczych i nie ulega ekspresji w innych makrofagach, w tym w komórkach SPM lub Kupffera (18, 23, 24), a także nie występuje w komórkach fagocytarnych nerek, monocytach, neutrofilach lub neutrofilach, które migrowały do nerek (uzupełniająca Fig.5). Aby określić rolę LPM w jamie otrzewnej, użyliśmy myszy Lyz2-Cre GATA6fl/FL (GATA6-KOmye), które nie mają większości makrofagów GATA6+, ale donoszono, że nie mają innych defektów fenotypowych (18, 23, 24). Nic dziwnego, że w porównaniu z grupą kontrolną z drobnoustrojami myszy te nie wykazywały żadnej różnicy w obciążeniu bakteryjnym w wątrobie (Fig.3A), ponieważ populacja komórek Kupffera nie ulega zmianie u myszy GATA6-KOmye (24). Ponadto liczba bakterii we krwi była również bliska granicy wykrywalności i nie różniła się między 2 szczepami myszy (Fig.3B). Jednak w 48 godzinach po zakażeniu widzieliśmy znaczącą 100-krotną redukcję bakterii związanych z nerkami myszy, które nie miały GATA6+ LPM wykazujących rolę tych komórek w S. aureus rozprzestrzeniania się do narządów otrzewnej (ryc. 3C). We wczesnych punktach czasowych 12 godzin po zakażeniu nie zaobserwowano różnic w obciążeniu bakteryjnym w nerkach myszy WT i GATA6-KOmye (Fig. 3D), co sugeruje, że małe wczesne zakażenie nerek nie jest związane z jamą otrzewnową lub makrofagami GATA6+.

brak makrofagów otrzewnowych powoduje większą rekrutację neutrofili, aryc. 3

brak makrofagów otrzewnowych powoduje większą rekrutację neutrofili i mniejsze rozprzestrzenianie się S. aureus do nerek. Myszy GATA6-KOmye lub grupy kontrolnej z littermate zostały zakażone i. v. (A-H) lub i. p. (I I J) dla wskazanych punktów czasowych szczepem 5 × 107 S. aureus Newman. (A–E I J) pobrano organy i oznaczono CFU; pokazano średnią geometryczną. n = 5-10 z co najmniej 2 niezależnych eksperymentów, test Manna-Whitneya, *p < 0,05. (F) lokalizacja komórek S. aureus wewnątrz jamy otrzewnej określona za pomocą cytometrii przepływowej, średni procent. n = 5 (WT) lub 6 (GATA6-KOmye). (G I I) liczba neutrofili w jamie otrzewnej oceniana za pomocą cytometrii przepływowej. n = 5-6, średnia ± sem, niesparowany test t, **p < 0, 01. (H) utrata masy ciała, n = 6-9 z 3 niezależnych eksperymentów, średnia ± sem, niesparowany test t, *p < 0,05.

obciążenie bakteryjne w jamie otrzewnowej było takie samo u myszy GATA6-KOmye i kontrolerów littermianu (Fig.3E). Jednak przy braku LPM u tych myszy większość S. aureus stwierdzono w neutrofilach (Fig. 3F) częściowo z powodu dużego wzrostu liczby neutrofili (Fig.3G). Oczywiście, bakterie nie były w stanie rozprzestrzeniać się tak skutecznie, gdy w neutrofilach zamiast makrofagów GATA6+. Myszy GATA6-KOmye również wydawały się zdrowsze i traciły mniej masy ciała niż mniejsze grupy kontrolne (rycina 3H).

bezpośrednie wstrzyknięcie S. aureus do jamy otrzewnej spowodowało bardzo znaczący wczesny (4 godziny) wzrost liczby neutrofili (1-2 miliony) do jamy otrzewnej (Fig.3i) z pewną infekcją nerek po 72 godzinach (Fig. 3J), jak opisano wcześniej (25). U myszy z niedoborem GATA6 napływ granulocytów obojętnochłonnych potroił się (4-6 milionów), a mniejsze obciążenie bakteryjne odnotowano w nerkach 3 dni po infekcji IP(Fig. 3, I I J). Kiedy mierzyliśmy poziomy chemokin rekrutujących neutrofile, CXCL1 i CXCL2 w jamie otrzewnej, byliśmy zaskoczeni, że bardzo silny wzrost nastąpił 4 godziny po wstrzyknięciu IP S. aureus, ale nie po pierwszych 24 godzinach wstrzyknięcia dożylnego bakterii (uzupełniający Rysunek 6).

S. aureus infekuje nerkę głównie z otrzewnej, a nie unaczynienia. Do wizualizacji s wykorzystano 2-fotonowy mikroskop doodbytniczy Leica Dive (IVM). aureus w mikrowaskulaturze nerek, w tym kłębuszków nerkowych, które u dorosłych myszy są prawie niemożliwe do wizualizacji za pomocą standardowego IVM ze względu na ich głębokość pod powierzchnią. Byliśmy również w stanie zszyć obrazy, tak aby można było obserwować aż 20 kłębuszków jednocześnie, które następnie można było powiększać w razie potrzeby i pojawiać się jako małe szare sferoidy (ryc. 4A i uzupełniający ryc. 7A). Pomimo ogromnej sekwestracji S. aureus w mikrowaskulaturze wątroby (Fig. 1A) w ciągu pierwszych 30 minut zakażenia obserwowano bardzo niewiele bakterii przyklejonych (stacjonarnych) w mikrowaskulaturze śródmiąższowej lub kłębuszkowej nerki (dodatkowe Filmy 4-6). Ponadto, w rzadkich przypadkach obserwowaliśmy spożycie bakterii w neutrofilach przyłączonych do naczyń włosowatych, ale komórki te następnie oderwały się od naczyń nerkowych i ponownie weszły do głównego nurtu krwi (ryc. 4B i dodatkowe wideo 5). Neutrofile nigdy nie ulegały przedłużonemu zatrzymywaniu w naczyniach nerkowych. Nie było trwałego wzrostu S. aureus w żadnym z wielu kłębuszków u niezliczonych myszy, które obrazowaliśmy. W rzeczywistości znaleźliśmy tylko 1 kłębuszek zakażony S. aureus w 72 godzinach po zakażeniu (dodatkowa rycina 7A). Ponadto niektóre badania sugerują, że fagocyty nerek cx3cr1 + monitorują mikrowaskulaturę nerek i wyłapują bakterie Gram-ujemne i cząstki stałe z krążenia (26, 27). W naszych doświadczeniach obrazowania, jednak, nie CX3CR1 + fagocyty nerek zawierały żadnych bakterii w ciągu pierwszych 30 minut po IV. infekcja (uzupełniające wideo 6) oraz dane z cytometrii przepływowej pokazują, że nie zmienia się to w czasie, nigdy nie wzrasta powyżej 0,5% (uzupełniające rysunek 7b). Podczas gdy bardzo nieliczne bakterie obserwowane w nerkach za pomocą obrazowania są całkowicie zgodne z bardzo nielicznymi CFU (104 CFU) wykrytymi w ciągu pierwszych 24 godzin, brak rekrutacji neutrofili i brak bakterii w różnych przedziałach nerki nie były zgodne ze zwiększonym obciążeniem bakteryjnym w nerkach przez 24 godziny.

S. aureus najpierw infekuje nerkę w kapsułce, a następnie nacieka i ryc. 4

S.aureus infekuje nerkę początkowo na kapsułce, a następnie infiltruje do śródstopia. A) reprezentatywny 2-fotonowy obraz z nerki o głębokości około 150 µm, w którym widać około 20 kłębuszków (po lewej). Naczynia krwionośne, w tym kłębuszki pojawiają się w kolorze szarym (AF680-albumina), kanaliki pojawiają się w ciemnożółtym autofluorescencji, A S. aureus jest w jasnozielonym GFP (niewidoczny). Prawy panel pokazuje 3 powiększone kłębuszki. B) Dwufotonowe obrazy IVM z kłębuszków (film uzupełniający 5) w ciągu pierwszych 10 minut infekcji dożylnej 5 × 107 S. aureus Newman. Unaczynienie (kłębuszek) jest pokazane na niebiesko (Qtracker 655), kanaliki są autofluorescencyjne we wszystkich kanałach i pojawiają się na brązowo wokół kłębuszka, neutrofile są oznaczone na Czerwono (Ly6G-PE), a GFP S. aureus pojawia się na Żółto wewnątrz neutrofili (biała strzałka). C) reprezentatywne szyte obrazy z powierzchni nerek we wskazanych punktach czasowych po zakażeniu. Pasek skali: 500 µm. S. aureus (jasny zielony) jest zakreślony na biało, a powiększony widok bakterii na powierzchni po 48 godzinach jest pokazany. D) 3D reprezentacja FOV nerki 48 godzin po zakażeniu GFP S. aureus (jasnozielony) na kapsułce (fioletowy kolagen/druga harmoniczna generacja) i unaczynienie w kolorze szarym (AF680-albumina). E) reprezentatywny FOV nerki 72 godziny po zakażeniu, widok z dołu stosu Z. Kanaliki pojawiają się w kolorze brązowym, GFP S. aureus jest jasnozielony i oznaczony białymi strzałkami. F) Analiza lokalizacji bakterii oznaczonej za pomocą 2-fotonowego IVM nerki. Analizowano sześć FOV na mysz (n = 3-4 na punkt czasowy).

co ciekawe, nie stwierdzono wzrostu liczby przylegających neutrofili w kłębuszkach nerkowych lub w śródmiąższowej mikrowaskulaturze do 72 godzin po zakażeniu (Uzupełnienie rycina 8A). Neutrofile utrzymywały się zarówno w kłębuszkach nerkowych, jak i w śródmiąższowej mikrowaskulaturze nerek przez około 2 do 3 minut w Warunkach podstawowych, a wartość ta nie zwiększała się z czasem po zakażeniu (uzupełniająca Fig. Oceniliśmy również rekrutację leukocytów nerkowych za pomocą cytometrii przepływowej trawionych nerek. Eksperymenty te ujawniły niewielki wzrost całkowitej liczby neutrofili w nerkach po 48 godzinach, a następnie dramatyczną rekrutację w 72 godzinach po zakażeniu (uzupełniające rycina 8, C I D). Warto zauważyć, że bardzo niewiele neutrofili spożyło S. aureus w ciągu pierwszych 24 godzin, a nawet w 48 i 72 godzinach tylko 15% zrekrutowanych neutrofili było dodatnich dla GFP S. aureus (uzupełniający Rysunek 8, E I F), co wskazuje na słaby dostęp do bakterii.

liczbę neutrofili we krwi badano również za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia liczby neutrofili, które wiązały się lub przyjmowały S. aureus. Liczba granulocytów obojętnochłonnych zawierających GFP S. aureus była konsekwentnie mniejsza niż 0,1% całkowitej liczby przez całe 72 godziny po zakażeniu (uzupełniająca rycina 9) pomimo ogromnego wzrostu obciążenia bakteryjnego związanego z nerkami. Wraz z obrazowaniem wykazującym brak bakterii w naczyniach krwionośnych i tych danych cytometrii przepływowej, brakowało przekonującego poparcia dla panującego poglądu, że bakterie docierają do nerek poprzez naczynie wewnątrz neutrofili lub nawet jako wolne jednostki.

ponieważ wydaje się, że bakterie nie rozprzestrzeniają się przez unaczynienie, wizualizowaliśmy nerki z aspektu otrzewnowego, a na zdjęciach przeglądowych widzieliśmy wzrost bakterii w kapsułce nerkowej po 24 godzinach (nie pokazano), 48 godzinach i 72 godzinach (rysunek 4C). Chociaż po 24 godzinach bakterie wydawały się być w małych koloniach mocno przylegających i posypane na powierzchni kapsułki nerek (nie pokazano), kolonie te rosły zauważalnie po 48 godzinach tworząc biofilmy ze skoncentrowanymi obszarami intensywnej fluorescencji sugerując izolowane obszary dużych kolonii. O ile nie odnotowano tego zjawiska u ludzi, jest mało prawdopodobne, aby te grudki bakterii zostały wykryte za pomocą ultradźwięków i innych metod klinicznych. Warto zauważyć, że średnie obciążenie bakteryjne nie zmieniło się znacząco między 24 A 72 godzinami, a bakterie wydawały się być znacznie mniej rozproszone i bardziej skoncentrowane kępy w późniejszych punktach czasowych. Mikroskopia dwufotonowa i zastosowanie generacji drugiej harmonicznej (oznaczającej kolagen) w celu określenia lokalizacji torebki nerkowej ujawniły bakterie przyczepione do powierzchni, a nie poniżej kapsułki po 48 godzinach (ryc. 4D i dodatkowe wideo 7), podczas gdy po 72 godzinach bakterie stały się widoczne głębiej w miąższu (ryc. 4e). W ciągu 72 godzin infekcja rozprzestrzeniła się z powierzchni nerki do śródstopia, ale prawie nigdy nie była widoczna w kłębuszkach nerkowych (Uzupełnienie rycina 7A). Kwantyfikacja całkowitej liczby poszczególnych bakterii / skupisk bakterii wykazała, że w ciągu 24 godzin wszystkie bakterie znajdowały się w kapsułce nerkowej, podczas gdy w 48 i 72 godzinach w śródstopiu obserwowano wzrost liczby bakterii (Fig.4F). Ta obserwacja sugerowała, że bakterie infekowały nerki z zewnętrznej powierzchni do wewnątrz przez jamę otrzewnową. Zgodnie z tym pomysłem, powszechnie wiadomo, że wstrzyknięcie bakterii bezpośrednio do jamy otrzewnej prowadzi do powstania ropnia początkowo na powierzchni nerek, a następnie inwazji do śródstopia (16, 25), często używany model niewydolności nerek. Oceniliśmy również śmierć komórek w nerkach i zaobserwowaliśmy bardzo małą śmierć komórek kanalików po 24 godzinach, ale była ona znacznie zwiększona po 48 i 72 godzinach (dodatkowa rycina 8, G I H). Stężenie kreatyniny w osoczu mierzono również jako wskaźnik szybkości przesączania kłębuszkowego i zaburzenia czynności nerek, ale dane nie wykazały korelacji z miejscowym zakażeniem. Nie stwierdzono zwiększenia stężenia kreatyniny w surowicy w żadnym punkcie czasowym, z wyjątkiem 24 godzin(uzupełniająca rycina 4i). Tymczasowy wczesny wzrost kreatyniny jest zgodny z naszym raportem, że α-Toksyna uwalniana do krwiobiegu z sequesterowanego przez wątrobę S. aureus powodowała agregację płytek w naczyniach włosowatych, w tym kłębuszkach nerkowych, co prowadziło do przejściowo upośledzonej filtracji (28).

zbiornik aureus w jamie otrzewnej z wypełnionymi antybiotykami liposomami zapewnia lepsze przeżycie. W przypadku zakażeń krwiobiegu u ludzi zaleca się dożylne podawanie wankomycyny, silnego antybiotyku S. aureus, przez co najmniej 4 do 6 tygodni, chociaż sukces może być ograniczony (5). W prezentowanych doświadczeniach dożylne podawanie wankomycyny przez 1, 2 lub 3 dni począwszy od 24 godzin po zakażeniu (w celu naśladowania sytuacji klinicznej)miało marginalny wpływ na obciążenie bakteryjne związane z nerką lub otrzewną po 72 godzinach (Fig. 5A i uzupełniające Fig. 10A). Ponadto liczba martwych komórek kanalików (Fig. 5, B I C), utrata masy ciała (uzupełniająca Fig. 10B) i przeżywalność (Fig.5D) nie uległy poprawie. Co ciekawe, podział dawki wankomycyny i podanie połowy dożylnie, a drugiej połowy do jamy otrzewnowej zmniejszyło infekcję w jamie otrzewnowej, zmniejszyło liczbę bakterii i uszkodzeń kanalików nerkowych oraz znacznie poprawiło śmiertelność (ryc. 5, A-D). Wcześniej informowaliśmy, że wolna wankomycyna nie wnikała dobrze do makrofagów tkankowych (10). Natomiast wankomycyna włączona do liposomów (wankosomów) była żarłocznie pobierana przez komórki Kupffera 30 minut po zakażeniu, co przyczyniło się do wytępienia S. aureus wewnątrz tych komórek (10). Jednak protokół 30 minut po zakażeniu użyty w naszym poprzednim badaniu, chociaż wystarczający do potwierdzenia koncepcji, jest mało prawdopodobne, aby był klinicznie istotny. Ponieważ bakterie są uwalniane z wątroby do jamy otrzewnej po około 8 godzinach, podawanie dożylne wankosomów w ciągu 24 godzin byłoby za późno. Dlatego wstrzyknęliśmy vancosomes i. p. w ciągu 24 godzin i zaobserwował ogromny pobór tych liposomów przez makrofagi otrzewnowe. Warto zauważyć, że po podaniu liposomów i.p. były one w stanie uzyskać dostęp do naczyń krwionośnych, w których były pobierane przez komórki Kupffera, ale nie przez komórki fagocytujące nerki (uzupełniająca Fig.11). W związku z tym wankosomy nie funkcjonowały w obrębie makrofagów nerek.

wankomycyna Dootrzewnowa (wankosomy) jest ukierunkowana na tkankę rezydującą m ryc. 5

wankomycyna Dootrzewnowa (wankosomy) jest ukierunkowana na tkankę rezydującą w makrofagach w celu wyeliminowania infekcji i utrzymania przeżycia. Myszy zakażono dożylnie 5 × 107 S. aureus Newman i 2 razy (24 godziny plus 48 godzin, A–C) lub 3 razy (24 godziny plus 48 godzin plus 72 godziny, D) wankomycyną dożylnie (czerwoną), wankomycyną dożylnie (niebieską), połączeniem wankomycyny dożylnie plus IP (pomarańczową) lub wankomycyną dożylnie plus wankomycynę dożylnie (zieloną). A) siedemdziesiąt dwie godziny po zakażeniu pobrano narządy, wykonano płukanie otrzewnej i oznaczono CFU (n = 6-11 z 3 niezależnych eksperymentów). Dane przedstawiono jako średnią geometryczną; Kruskal-Wallis z testem post Dunna; *p < 0,05 i * * p < 0,01. B) reprezentatywne 2-fotonowe obrazy IVM nerek 72 godziny po zakażeniu z lub bez leczenia 2 razy. Martwe komórki kanalikowe zabarwione są na pomarańczowo (czerwono), kanaliki pojawiają się w ciemnozielonej autofluorescencji. Pasek skali: 75 µm. C) Analiza B. Liczba komórek Sytox Orange + (martwych) z 8 FOV na mysz, dane reprezentują średnią ± sem (n = 3, 1-drożna ANOVA z testem wielokrotnych porównań Bonferroniego). *P < 0, 05, ***P < 0, 001 I *** * P < 0, 0001. (D) krzywa przeżycia myszy zakażonych S. aureus i leczonych (N = 4 myszy na grupę z 2 niezależnych eksperymentów). Test log-rank w porównaniu z wankomycyną dożylnie, *p < 0, 05 i * *p < 0, 01.

Głębokie zmniejszenie obciążenia bakteryjnego w jamie otrzewnej po wankosomach zmniejszyło obciążenie bakteryjne w nerkach u 50% myszy (Fig. 5A) i doprowadziło do mniejszego uszkodzenia nerek (Fig.5, B I C) i lepszego przeżycia (Fig. 5D). Co ciekawe, niektóre bakterie nadal rosły na kapsułce nerkowej, co sugeruje, że wankosomy były mniej skuteczne w zabijaniu bakterii zewnątrzkomórkowych. Zaobserwowaliśmy lepszą eradykację wolnych bakterii z wankomycyną i lepszą eradykację bakterii wewnątrzkomórkowych z wankozomami(Uzupełnienie Fig. 10C). Połączenie wankomycyny i.v. i wankosomy i. p., które byłyby najbardziej prawdopodobnym wyborem w badaniu klinicznym, oczyściły wszystkie bakterie w jamie otrzewnej u wszystkich myszy i żadne bakterie nie dotarły do nerek u ponad 50% myszy (Fig.5A). Gdy myszy leczono tylko 1 wstrzyknięciem w ciągu 24 godzin, wyniki były umiarkowanie mniej skuteczne (uzupełniająca Fig.10A). Co najważniejsze, myszy leczone tandemowymi wankozomami i. p.i wankomycyną i. v. zwiększały przeżywalność o 80% po 10 dniach, pomimo tylko 3-dniowego schematu antybiotyków (rycina 5D). Protokoły te można łatwo przełożyć na praktykę kliniczną u zakażonych pacjentów.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.